Práctica 7: Recuento y viabilidad celular.

1. Objetivo.

Averiguar el número de células vivas de nuestro cultivo celular.

2. Fundamento.

Para iniciar un cultivo, así como realizar un seguimiento del mismo, se debe conocer la densidad celular en número de células/ml. Las células contadas deben estar vivas, por lo que también debemos de comprobar su viabilidad. Ambos procesos se realizan simultáneamente mediante los métodos de coloración vital con azul tripán (colorante que penetra en las células cuya membrana está rota) y recuento o contaje celular con un hemocitómetro denominado cámara de Neubauer. La cámara de Neubauer es un portaobjetos que tiene dos zonas ligeramente deprimidas en cuyo fondo se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula de dimensiones conocidas. Se cubre la cámara con un cubreobjetos que se adhiere por simple tensión superficial (en especial una vez que se haya añadido la muestra líquida).

3. Material y reactivos.

• Gradilla.
• Tres tubos Eppendorf.
• Colorante azul tripán.
• Micropipeta.
• Puntas de micropipetas.
• Cultivo celular en T-flask.
• Alcohol.
• Contenedor o vaso de precipitado para residuos.
• Cámara de Neubauer (reutilizable o desechable)

4. Procedimiento.

Comenzaremos dejaremos activado la opción de rayos UV en la cabina de flujo laminar durante 10 minutos debido a su acción germicida, sin todavía colocar en la superficie ningún material; mientras tanto, prepararemos cerca de la cabina y en un lugar seguro todos los materiales que introduciremos dentro de la misma, además del alcohol en pulverización. Cuando pasen los 10 minutos, rociaremos nuestras manos y los materiales con el alcohol y los introduciremos dentro de la cabina de flujo laminar. 

De nuevo impregnaremos los guantes de alcohol y seguidamente ordenaremos los materiales según el siguiente orden de trabajo:

Desenrroscaremos un poco el T-flask para luego abrirlo con facilidad con nuestra mano izquierda, debido a que con la derecha pipetearemos un volumen de 10 microlitros para cada Eppendorf. Para ello, cogeremos el T-flask e introduciremos en él diagonalmente la punta de micropipeta que previamente hemos colocado en la micropipeta. Como nuestra micropipeta era de volumen fijo, tan solo tuvimos que presionar fuera del líquido hasta el primer tope y soltarlo una vez que estuviera dentro. En cuanto terminemos de pipetear las tres cantidades, cerraremos el tapón del T-flask que dejamos boca arriba en la parte superior de la superficie; sin embargo, no será necesario cerrar los Eppendorfs debido a que tan solo los utilizaremos para observarlos al microscopio y tirarlos (la contaminación no incide en tan corto espacio de tiempo).

Una vez hayamos terminado de manipular el cultivo celular podremos pasar a terminar la actividad fuera de la cabina de flujo laminar. Cuando cambiemos la punta de la micropipeta, verteremos 10 microlitros de azul tripán en cada Eppendorf repitiendo el mismo procedimiento anterior. Cerraremos los Eppendorfs y mezclaremos ambos líquidos.

Así es como quedaron nuestros tres Eppendorfs. 

Por lo que tuvimos que utilizar una microcentrífuga para mezclar los líquidos correctamente.

Finalmente, cada una de las integrantes del grupo extrajo los 20 microlitros de un Eppendorf para transferirlos a la cámara de Neubauer que, en nuestro caso, era desechable. Para llevarlo a cabo, apretaremos el botón de la micropipeta fuera de la mezcla de líquidos y los soltamos una vez dentro de los Eppendorfs, y lo vertimos en las ligeras hendiduras que poseen ambos extremos de la cámara.

Los colocaremos en el microscopio óptico:

El recuento fue imposible de realizar debido a que el contenido se observaba en su gran mayoría de un vivo azul. Concluímos que ésto podría darse debido a dos factores que podrían haberse producido simultáneamente: todas o casi todas las células se encontraban lisadas o tenía demasiada concentración de azul tripán. No obstante, el último Eppendorf tenía muy poca cantidad del colorante, por lo que es probable que la micropipeta que utilizamos estuviese rota. Ésto fue lo único visible que obtuvimos:

5. Consideraciones de seguridad.

Debemos prestar especial atención a no utilizar nunca la cabina de flujo laminar con los rayos UV debido al riesgo cancerígeno que supone. Además, es indispensable utilizar bata y guantes en el laboratorio.

Si conectamos o desconectamos la cabina o el microscopio de la toma de contacto, deberemos atender a los riesgos que supone manejar instalaciones eléctricas (que el agua no toque la toma, desenchufar y enchufar con delicadeza, etc...). Respecto al microscopio, deberemos mantener la mejor ergonomía posible al realizar los procedimientos y no tocar la bombilla que ilumina el portaobjetos.
Extraeremos el cultivo de la estufa con cuidado para no golpear accidentalmente los T-flasks del resto de los compañeros y evitar salpicaduras y/o contaminaciones (recordemos que algunos T-flask están ligeramente abiertos).

Cerraremos el espejo de cristal y la puerta de la estufa, evitando dejarlas abiertas el mínimo tiempo posible para evitar la bajada de temperatura del interior de la estufa, la entrada de microorganismos exógenos a los cultivos o salida de aerosoles, entre otros. 

Deberemos colocar los tubos de forma equilibrada y simétrica en la microcentrífuga, así como cerrar su tapa correctamente.

6. Gestión de residuos.

Utilizamos un vaso de precipitado etiquetado como 'residuos' para verter las puntas de micropipeta.