Práctica 14: Extracción de ADN casera.

1. Objetivo.

Visualización de las fibras de ADN de la saliva.

2. Fundamento.

El ADN se encuentra en el interior del núcleo celular, disperso, muy replegado y unido a proteínas formando la cromatina. Para poder extraerlo es necesario romper las células y separar el núcleo para después volver a romperlo y liberar el ADN. Una vez liberado el ADN es necesario separarlo de las proteínas y provocar la precipitación de éstas para poder extraer el ADN. Extraeremos el ADN de una muestra de saliva, la cual en la boca arrastra las células del epitelio que recubre las paredes internas de la boca y que se están desprendiendo constantemente. Durante el enjuague el agua ha recogido las células que se desprenden de las encías, las paredes de la boca, la lengua, etc. 

3. Materiales.

• Gradilla.
• Tubo tipo Falcon.
• 2 vasos de precipitado.
• Agua destilada.
• Zumo de piña.
• Detergente.
• Sal.
• Embudo.

3. Procedimiento.

En primer lugar prepararemos las dos disoluciones que mezclaremos con es espécimen de saliva: el vaso 1 llevará 10 cucharadas de H2O (agua destilada) y 1 cucharada de NaCl (sal); por otro lado, el vaso 2 contendrá 2 cucharadas de detergente (en nuestro caso, mistol) y 6 cucharadas de H2O (agua destilada).

Vaso 1:

Sobre el vaso de precipitado apretamos el frasco lavador para que caiga el agua destilada de su interior sobre la cuchara. Cuando esté llena al completo, giraremos la cuchara y el agua caerá en el vaso de precipitado. Repetiremos el proceso 9 veces más.

Le introduciremos al agua destilada una cucharada de NaCl y homogeneizaremos la disolución agitando con la cuchara en movimientos circulares y no muy bruscos.

Vaso 2:

Volveremos a realizar el mismo proceso de antes pero ésta vez verteremos primero 6 cucharadas de agua destilada y, más tarde, 2 cucharadas de detergente. Pondremos cuidado a la hora de agitar la disolución, haciéndolo lentamente y con delicadeza, con el objetivo de que se formen las mínimas burbujas posibles.

Nos enjuagaremos la boca durante 30-40 segundos y escupiremos la muestra de saliva dentro de un vaso de plástico (esputo). La saliva la mezclaremos con 2 cucharadas de zumo de piña que verteremos en el vaso de plástico.

A la disolución de saliva y zumo de piña le añadiremos 1 cucharada del contenido de cada vaso de precipitado que preparamos anteriormente (vaso 1 y 2). Para homogeinizar todos los líquidos del vaso, lo moveremos en círculos con delicadeza. 

Ésta última disolución resultante la tendremos que introducir en un tubo Falcon (importante que contenga un sistema de medición) mediante el embudo, colocando su la parte del tubo del embudo dentro de la boca del tubo Falcon y vertiendo por la parte superior del embudo la disolución anterior. 

Finalmente la diluiremos lentamente un volumen de alcohol que sea al mismo que el que ocupe la disolución en el tubo, resultando una dilución con el doble de volumen que la anterior. Enrasaremos con la pipeta Pasteur cuando nos quede pocos milímetros para llegar a dicha medida.

Dejaremos reposar sobre la gradilla alrededor de 2 o 3 minutos hasta que precipiten según densidad y observamos qué ocurre en el tubo: aparecerán en la parte superior (sobre todo) fibras distintas al color del sobrenadante. Éstas fibras son el ADN de células epiteliales descamadas y/o leucocitos que conforman parte de la saliva humana.

5. Cuestiones.

1. Calcula las medidas reales en ml y g.

Una cucharada de agua equivale a 15 mililitros.

El detergente, al ser más viscoso, una cucharada de él corresponde a 30g.

Una cucharada rasa de sal equivale a 15 g.

Por tanto:

2. Explica para qué sirve cada sustancia o líquido usado en la práctica.

Para poder acceder al ADN primero tenemos que acceder al núcleo de la célula y para eso es necesario romper la membrana plasmática. Después debe romperse la membrana nuclear, para dejar libre el ADN. Por último debemos proteger el ADN de enzimas que puedan destruirlo y para aislarlo hay que hacer que se precipite en alcohol. La sal común (NaCl), con esa concentración, es un medio hipertónico que provoca el estallido de las células y los núcleos, quedando libre las fibras de cromatina. El detergente cumple la misión de formar un complejo con las proteínas histonas y separarlas del ADN El ADN es soluble en agua pero cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la interface alcohol – agua. El alcohol también separa el ADN de otros componentes celulares que son dejados en la solución acuosa. 

3. ¿Por qué no serviría éste protocolo para dar un resultado viable?

Porque como el alcohol también separa el ADN de otros componentes celulares que son dejados en la solución acuosa, en realidad el procedimiento descrito es para separar ácidos nucleicos, por lo que obtenemos una mezcla de ADN y ARN (y no solo de ADN).

6. Consideraciones de seguridad. 

-Mantenimiento del orden en el área de trabajo para evitar, entre otros,

posibles caídas de reactivos y material de vidrio.

-Examinar el estado de las piezas antes de utilizarlas y desechar las que

presenten el más mínimo defecto.

-Desechar el material que haya sufrido un golpe de cierta consistencia,

aunque no se observen grietas o fracturas.

7. Gestión de residuos.

Los residuos generados fueron vertidos a una papelera común por su nula peligrosidad.