Práctica 2. Manejo de la cabina de flujo laminar.

1. Objetivo.

Al igual que en la primera práctica, deberemos seguir tomando confianza y/o manejo con los instrumentos del laboratorio de Biología Molecular. La cabina de flujo laminar es la cabina que usaremos con mayor frecuencia durante todo el curso, siendo indispensable aprender a manejarla correctamente y con fluidez.

2. Fundamento. 

Una cabina de flujo laminar, cámara de flujo laminar o campana de flujo laminar es un recinto que emplea un ventilador para forzar el paso de aire a través de un filtro HEPA o ULPA y proporcionar aire limpio a la zona de trabajo libre de partículas de hasta 0.1 micras. El material utilizado en la Biología Molecular es altamente susceptible a la contaminación debido a, principalmente, arnasas en el ambiente; en consecuencia, es imprescindible prevenirlas a toda costa mediante éste tipo de equipo (entre otros).

3. Materiales.

• Puntas de micropipetas.
• Tubos Eppendorfs.
• Papel de filtro.
• Gradilla.
• Asas de siembra.
• Cabina de flujo laminar.
• Dos disoluciones de diferente color.

4. Procedimiento.

En primer lugar, esterilizaremos la cabina mediante el método físico de descontaminación con rayos UV, cuya acción germicida se conecta con un botón de la parte superior de la máquina que dejaremos accionada durante 10 minutos.

Mientras los rayos UV hacen su efecto, el profesor nos proporcionó dos disoluciones diferenciadas en su etiquetado (1 y 2) y color (azul y amarillo, respectivamente) para extraer de ellas los siguientes volúmenes:

Como las micropipetas miden los volúmenes en microlitros, deberemos pasar las anteriores cifras de mL a microlitros multiplicando x 1000 cada valor.

Una vez estén listas todas las operaciones, habrá pasado el tiempo de espera suficiente de los rayos UV de la cabina de flujo laminar. Por tanto, desconectaremos los mismos y conectaremos las luces normales, aunque también se pueden conectar directamente las luces de visión debido al sistema de seguridad de la cabina que desconecta automáticamente la luz UV al accionar la anterior. 

Una vez así, depositaremos dentro de la cabina el papel de filtro como superficie de trabajo. 

El papel de filtro será el lugar en el que coloquemos las dos disoluciones en la parte superior izquierda; las puntas de micropipetas, en la parte superior derecha; en la parte superior central, el envase de residuos y en el centro del mismo, la gradilla con 4 tubos Eppendorf que etiquetaremos de la A a la D.

Como cada fila pertenece a un tubo Eppendorf, los volúmenes de cada una serán vertidos en ellas mediante una micropipeta a la que previamente se le fue colocada su punta correspondiente ejerciendo presión (nunca tocándola para evitar la contaminación). Al ser los volúmenes diferentes, debemos utilizar la micropipeta más precisa posiblei; intentaremos utilizar las micropipetas fijas antes que las manuales y que éstas abarquen la cantidad más cercana o igual a la requerida. 

• Eppendorf A: necesitamos 200 microlitros de la disolución 1 (azul), por lo que la micropipeta utilizada será manual y con un intervalo de 20 a 200 microlitros. Girando el émbolo la adaptaremos a los 200 microlitros que nos piden, el cual es el volumen máximo permitido de la micropipeta. Presionamos hasta el primer tope del émbolo de e introducimos verticalmente la punta en la disolución sin soltar; una vez introducida, soltaremos el émbolo y quedará dentro de ella el volumen deseado. Con el volumen introducido dirigiremos nuestra mano hacia el Eppendorf A (habiendo abierto antes con la mano izquierda el tapón del tubo) donde verteremos la totalidad del contenido presionando hasta el primer tope y, seguidamente, hasta el segundo tope. Cerraremos el tapón presionando con la mano izquierda nuevamente, y colocaremos el Eppendorf en la línea horizontal que se encuentre encima de las que estén todas las demás para diferenciarla de las que están vacías.      

Desechamos la punta presionando el botón de la parte superior que está justo debajo del émbolo y, más tarde, presionaremos la micropipeta con otra punta de micropipeta esterilizada que corresponda al siguiente volumen que sustraeremos de la disolución 2. Repetiremos el mismo proceso pero ésta vez con una micropipeta manual de intervalo 10-1000 microlitros para conseguir 560 microlitros de la amarilla. 

Cuando ambas disoluciones estén contenidas en el mismo Eppendorf (A), las mezclaremos presionando delicada y lentamente el émbolo, haciendo con él un corto recorrido para evitar salpicaduras que hagan variar nuestro volumen total y puedan causar riesgos innecesariamente.

Repetiremos el mismo proceso con cada tubo, acordándonos de cambiar las puntas para adaptarlas a cada volumen y desechándolas cada vez que sea necesario. A continuación, éstas fueron las micropipetas utilizadas:

• Eppendorf B: micropipeta fija de 1.000 microlitros y manual de intervalo 20-200 microlitros.

• Eppendorf C: micropipeta manual de intervalo 100-1000 microlitros y fija de 5 microlitros.

• Eppendorf D: micropipeta fija de 8 microlitros y manual de intervalo 100-1000 microlitros.

5. Resultados y análisis de resultados.

El volumen de las disoluciones resultantes fue de 760 microlitros (A), 1.030 microlitros (B), 105 microlitros (C) y 838 microlitros (D), todas ellas de distintas concentraciones.

6. Consideraciones de seguridad.

Debemos prestar especial atención a no utilizar NUNCA la cabina de flujo laminar con los rayos UV debido al riesgo cancerígeno que supone. Además, a pesar de que no hemos utilizado reactivos peligrosos, es indispensable utilizar bata y guantes en el laboratorio. 

Si conectamos o desconectamos la cabina de la toma de contacto, deberemos atender a los riesgos que supone manejar instalaciones eléctricas (que el agua no toque la toma, desenchufar y enchufar con delicadeza, etc...)

7. Gestión de residuos.

Utilizamos un vaso de precipitado etiquetado como residuos para depositar los únicos que produjimos durante el proceso: las puntas de micropipeta. Colocamos el mismo en la parte superior central para que sea más fácil el vertido en su interior.