Práctica 3: Técnica aséptica básica.

1. Objetivo.

Realización correcta de la técnica aséptica en el procedimiento de trasvase de penicilina para un futuro cultivo celular, siendo indispensable su aprendizaje y posterior interiorización de la misma en la Biología Molecular debido a la facilidad de contaminación de las muestras de ácidos nucleicos.

2. Fundamento.

La técnica aséptica reúne un conjunto de procedimientos y actividades que se realizan con el fin de disminuir al mínimo las posibilidades de contaminación por sustancias no amplificadas presentes en la superficie de trabajo, del propio trabajador y microorganismos ambientales, así como la contaminación por carryover (contaminación de sustancias amplificadas). Éstos procedimientos están encaminados a la reducción o eliminación de arneasas, desoxirribonucleasas y microorganismos.

3. Materiales.

• Cabina de bioseguridad tipo II.
• Penicilina en un frasco.
• Tubo cónico tipo Falcon.
• Pipeta.
• Auxiliar de pipeteo (automático o manual) o pera de caucho.
• Gradilla.

4. Procedimiento.

En primer lugar, esterilizaremos la cabina mediante el método físico de descontaminación con rayos UV, cuya acción germicida se conecta con un botón de la parte superior de la máquina que dejaremos accionada durante 10 minutos. 

Para practicar antes de llevar a cabo la práctica con una sustancia que se utilizará para un futuro cultivo celular, la realizaremos con agua; no obstante, un compañero de cada grupo repetirá el proceso en condiciones reales.

Mientras los rayos UV hacen su efecto, colocaremos todo el material necesario cerca de la cabina de bioseguridad y esperaremos. Cuando termine, desconectaremos los rayos UV y conectaremos las luces normales, aunque también se pueden conectar directamente las luces de visión debido al sistema de seguridad de la cabina que desconecta automáticamente la luz UV al accionar la anterior. Una vez así, rociaremos nuestras manos enguantadas con alcohol para seguidamente hacer lo mismo con todos los materiales del laboratorio necesarios e introducirlos uno a uno dentro de la cabina. Volveremos a rociar nuestras manos por última vez.

Una vez metidas las manos dentro de la cabina, ya no se deberán sacar. Organizaremos el área de trabajo dentro de ella para tener fácil acceso sin alcanzar más de un objeto antes de llegar al que queremos o tocar la punta de la pipeta con algo no estéril. En nuestro caso, colocamos la gradilla con el tubo cónico en la parte superior izquierda; el envase para los residuos, en la parte superior derecha; en la zona superior central, un frasco con agua (simulando penicilina) y la pipeta y su auxiliar, en la derecha. La organización del área de trabajo debe ser específica a cada práctica que se realice, estando ésta adaptada a los distintos procedimientos que se vayan a realizar. Finalmente, la nuestra quedó así:

Cuando estén correctamente colocadas (teniendo en cuenta que somos diestros), procederemos a seguir con la práctica dentro de la cabina. 

En primer lugar, desenrroscaremos los tapones del tubo cónico y el frasco con agua (penicilina) con el objetivo de que luego nos sea más fácil de abrir con una sola mano (ya que la otra estará ocupada). Abriremos el plástico que contiene la pipeta por la parte superior de la misma, abriendo cada cara con una mano diferente. Debe quedar asomada del plástico la punta superior de la pipeta para, con la mano derecha, coger y colocar mediante presión el pipeteador automático en ella, sujetándo la pipeta con la mano izquierda. Solo tendremos que sujetar el plástico con la mano izquierda y el auxiliar con la derecha, sacando así la pipeta de ella separando ambas manos. El plástico será colocado en el envase de residuos.

Para trasvasar el agua (penicilina), abriremos el tapón que previamente ha sido desenroscado y lo colocaremos boca arriba en un lugar que no estorbe de la superficie de trabajo (en uno de los extremos o bordes), todo ello con la mano izquierda. Introduciremos verticalmente la pipeta en él y, más tarde, sujetaremos con la mano izquierda el frasco con agua (penicilina). La correcta manera de pipeteo será colocando de forma diagonal el frasco (¡sin que se derrame, muy importante!), quedando éste cerca de la boca de la pipeta. La pipeta será introducida verticalmente en dicha boca y succionaremos con el botón superior hasta la marca 0 debido a que es una pipeta de volumen vertido (TD, Ex). En el enrase, deberemos subir la marca hasta que exista una línea totalmente horizontal imaginaria entre nuestros ojos y la línea. Cogemos el tapón con la mano izquierda (con cuidado de no tocar con los guantes la cara interior, la cual estará mirando hacia arriba) y lo dejamos encima del frasco, sin ejercer presión ya que no podemos enroscarlo con una sola mano.

Dirigimos la pipeta con la mano derecha al tubo cónico, en el que abriremos con la mano izquierda su tapón y lo dejaremos boca arriba en un lugar cercano. Vertemos con el botón inferior del auxiliar el volumen deseado (12 ml.) en el tubo, introduciéndolo verticalmente tras haber cogido el tubo con la mano izquierda y habiéndolo colocado en dirección diagonal. Con la técnica descrita anteriormente, vaciaremos y enrasaremos en dicho volumen. 

Cuando esté vertido, nuevamente el tubo volverá a la gradilla y le colocaremos encima el tapón (también con cuidado de no tocar la parte que mira hacia arriba). Verteremos el resto de líquido sobrante contenido en la pipeta en el frasco inicial en el que estaba, sacando antes el tapón con la mano izquierda y colocándolo boca arriba en la superficie de trabajo. Cuando esté totalmente dentro, volveremos a dejar el tapón en el sitio en el que estaba.

Separaremos la pipeta de su auxiliar, dejando la pipeta en el envase de residuos y el auxiliar en su base correspondiente. En cuanto haya sido colocado en su lugar, enroscaremos los tapones del tubo cónico y del frasco.

Ya tendremos preparado el volumen de 'penicilina' para su uso en cultivos celulares. Aquí algunas fotos de cuando la compañera de mi grupo lo realizó con penicilina real:

5. Resultados y análisis de resultados.

Obtenemos 12 ml de penicilina para futuros cultivos celulares.

6. Consideraciones de seguridad.

Debemos prestar especial atención a no utilizar NUNCA la cabina de flujo laminar con los rayos UV debido al riesgo cancerígeno que supone. Además, es indispensable utilizar bata y guantes en el laboratorio, sobre todo en la realización de una correcta y adecuada técnica aséptica.

Si conectamos o desconectamos la cabina de la toma de contacto, deberemos atender a los riesgos que supone manejar instalaciones eléctricas (que el agua no toque la toma, desenchufar y enchufar con delicadeza, etc...).

Recordamos, además, la importancia de la no contaminación de la penicilina y del tubo que la contendrá, así como el volumen que verteremos en él. Es importante evitar, en medida de lo posible, la realización de la práctica en caso de alergia a la penicilina.

7. Gestión de residuos.

Utilizamos un vaso de precipitado grande etiquetado como residuos para depositar el plástico y la pipeta en él una vez fueron usados. Colocamos el mismo en la parte superior derecha.