Práctica 4: Cultivo celular.

1. Objetivo.

Realización de un cultivo celular de células eucariotas de insecto en un medio de penicilina preparado en la práctica anterior (3), prestando atención en efectuar las operaciones según la técnica aséptica aprendiendo en el tema 2 y aplicando el marco teórico del tema 10 (de cultivos celulares) a la práctica.

2. Fundamento.

El Real Decreto 664/1997, de 12 de mayo, define los cultivos celulares como el resultado del crecimiento in vitro de células obtenidas de organismos multicelulares. Por otro lado, podríamos determinarlo como el conjunto de procedimientos que hacen posible el mantenimiento de células de organismos pluricelulares in vitro, preservando al máximo sus características fisiológicas, bioquímicas y genéticas.

Los cultivos celulares son realizados a partir de suspensiones celulares introducidas en recipientes adecuados (T-flasks) junto con un medio de cultivo para posteriormente incurbarse en las condiciones óptimas para que las células proliferen. Éstos tienen múltiples aplicaciones tales como el estudio del metabolismo e interacción celular, producción de anticuerpos, producción de vacunas y fármacos, estudios de citotoxicidad, carcinogénesis y mutagénesis... podríamos destacar entre ellas la ingeniería de tejidos (producción in vitro de tejidos) y órganos así como el estudio de células madre para ser enfocados a la terapia celular.

3. Material y reactivos.

• Medio de cultivo (penicilina) en alícuota.
• Suspensión celular de insectos en T-flask.
• Gradilla.
• T-flasks.
• Pipeta de 10 ml.
• Pipeta de 2 ml.
• Auxiliar de pipeteo.
• Alcohol en pulverización.
• Cabina de flujo laminar.
• Baño termostático.

4. Procedimiento.

En primer lugar, colocaremos la alícuota con el medio de cultivo (penicilina) contenido en él dentro del baño termostático, el cual programaremos a 37º.

Tal y como se ha mencionado anteriormente, es necesario realizar todos los procedimientos en condiciones asépticas. Comenzaremos dejaremos activado la opción de rayos UV en la cabina de flujo laminar durante 10 minutos debido a su acción germicida, sin todavía colocar en la superficie ningún material; mientras tanto, observaremos la suspensión celular por un microscopio invertido y prepararemos cerca de la cabina y en un lugar seguro todos los materiales que introduciremos dentro de la misma, además del alcohol en pulverización (menos la alícuota con penicilina, que la dejaremos justo cuando vayamos a realizar la práctica para preservar el máximo tiempo posible los 37º).

Tras colocarnos todos los EPI correspondientes y haber pasado el tiempo mencionado de aplicación de rayos UV, rociaremos con alcohol nuestras manos enguantadas y posteriormente todos los elementos con los que trabajaremos, con cuidado y uno a uno. Deberemos prestar especial atención a no voltear el T-flask que contiene la suspensión celular, ya que estará un poco abierto y podría salir contenido al exterior. Cuando terminemos, volveremos a rociar nuestras manos.

Es importante que mantengamos un orden específico a cada práctica que hagamos; en la parte superior derecha colocaremos el envase etiquetado como 'residuos' y en la superior central, la gradilla con la alícuota. A nuestra derecha debe estar colocado el auxiliar de pipeteo y las pipetas dentro de su correspondiente envase que asegura su esterilización, así como a nuestra izquierda deben estar los dos T-flasks (uno con la suspensión celular y otro vacío).

Una vez esté todo preparado, comenzaremos con el proceso de cultivo propiamente dicho. Para separar las células de la superficie en la que están reposando, daremos pequeños toques a la pared del T-flask y 'recogeremos' las células volcando el líquido varias veces (¡cuidado! no debe caerle a la parte interior del tapón). Cuando lo realicemos unos minutos, desenroscaremos los tapones de la alícuota y los T-flasks con el objetivo de que luego nos sean más fáciles de abrir con una sola mano (ya que la otra estará ocupada). 

Así pues, primero introduciremos en el T-flask vacío 1 ml de la suspensión de células. Para ello, abriremos cada cara del plástico que contiene la pipeta de 2 ml. Debe quedar asomada del plástico la punta superior de la pipeta para, con la mano derecha, coger y colocar mediante presión el pipeteador automático en ella. Solo tendremos que sujetar el plástico con la mano izquierda y sacar la pipeta de él. El plástico será colocado en el envase de residuos.

Para trasvasar las células, abriremos el tapón del T-flask en el que esté contenido y lo cogeremos con la mano izquierda. La correcta manera de pipeteo será colocando de forma diagonal el T-flask (¡sin que se derrame, muy importante!), quedando éste cerca de la boca de la pipeta pero sin tocarla. Seguidamente sorberemos y verteremos pequeñas cantidades de líquido intentando no formar burbujas con la finalidad de que el mililítro que necesitamos tenga una concentración uniforme de células. Tras ello, enrasaremos 1 ml elevando ambos elementos hasta razar una línea horizontal imaginaria entre nuestros ojos y la base del menisco.

Éste volumen será trasvasado al T-falsk vacío, cuyo tapón tendremos que alejarlo y dejarlo boca arriba igualmente. Tal cual terminemos, verteremos la pipeta en el envase de residuos.

Con el mismo procedimiento anterior, colocaremos la pipeta de 10 ml en el auxiliar y enrasaremos 4ml en la alícuota con penicilina. Finalmente, verteremos el citado volumen en el T-flask y, cuando terminemos, la pipeta en el envase de residuos. Cerraremos todos los tapones con delicadeza pero, debido a que el modelo que utilizamos no tenía abertura suficiente, no apretamos del todo los T-flasks con el objetivo de facilitar el intercambio gaseoso con el medio. ¡Nuestro cultivo celular ya está listo! Ahora es el momento de meterlo dentro de la estufa de incubación a 37º para que las células proliferen, no sin previamente haber etiquetado un lateral del mismo con el nombre del grupo y la fecha. 

5. Consideraciones de seguridad.

Debemos prestar especial atención a no utilizar nunca la cabina de flujo laminar con los rayos UV debido al riesgo cancerígeno que supone. Además, es indispensable utilizar bata y guantes en el laboratorio.

Al manejar el microscopio y la estufa de incubación, deberemos atender a los riesgos que supone manejar instalaciones eléctricas (que el agua no toque la toma, desenchufar y enchufar con delicadeza, etc...).

Recordamos, además, la importancia de la no contaminación de la penicilina y el cultivo celular así como de los tubos que las contendrán. Éstos diversos factores se tratarán de evitar mediante una técnica aséptica óptima. 

Es importante evitar, en medida de lo posible, la realización de la práctica en caso de alergia a la penicilina.

Extraeremos el cultivo de la estufa con cuidado para no golpear accidentalmente los T-flasks del resto de los compañeros y evitar salpicaduras y/o contaminaciones (recordemos que algunos T-flask es

6. Gestión de residuos.

Utilizamos un vaso de precipitado grande etiquetado como residuos para depositar los plásticos y las pipetas en él una vez fueron usados. Colocamos el mismo en la parte superior derecha.

tán ligeramente abiertos).

Cerraremos el espejo de cristal y la puerta de la estufa, evitando dejarlas abiertas el mínimo tiempo posible para evitar la bajada de temperatura del interior de la estufa, la entrada de microorganismos exógenos a los cultivos o salida de aerosoles, entre otros.