Práctica 5: Seguimiento de la salud de los cultivos celulares.

1. Objetivo.

Examinar las células del cultivo celular (creado el día 23 de noviembre de 2018) para comprobar su estado de salud.

2. Fundamento.

Es importante examinar las células de nuestro cultivo periódicamente para comprobar que están sanas y se han realizado todos los procedimientos eficazmente.

Las contaminaciones en los cultivos celulares se refieren principalmente a la alteración del cultivo por la presencia de microorganismos no deseados y que son omnipresentes en el ambiente (bacterias, levaduras y hongos, micoplasmas y virus). Los principales microorganismos que podremos observar en el microscopio invertido serán bacterias, hongos y levaduras, respectivamente:

• Bacterias: los medios parecen nublados y pueden tener una película blanca en la superficie. Bajo el microscopio se verán células pequeñas y granulares, como puntos negros.
• Hongos: micelios filamentosos delgados que cubren el cultivo, como crecimiento borroso (típicamente blanco o negro) que es visible a simple vista.
• Levaduras: partículas redondas que son más pequeñas que las células de insectos. Normalmente se ve en cadenas de dos o más. 

Para evitar la contaminación es necesario aplicar la técnica aséptica en todo momento, la cual es un conjunto de medidas, procedimientos y actividades, destinados a disminuir la contaminación microbiana ambiental, del personal, de aquello que estamos cultivando, del material utilizado... . La técnica aséptica está reflejada en el marco legal del Decreto con fuerza de Ley Nº1, de 2005, del Ministerio de Salud, Articulo 4, Nº11.

La observación del cultivo celular se realizará mediante el microscopio invertido, el cual es un microscopio cuya estructura está invertida en comparación al microscopio convencional. La fuente de luz está ubicada por encima de la platina y el principio de funcionamiento y formación de la imagen es el mismo que el del microscopio tradicional.

Además de la posible contaminación, también observaremos la salud de las células (si están completamente sanas, enfermas u optotizadas) y la proporción de confluencia del cultivo celular. La confluencia se refiere al porcentaje de la superficie de una placa de cultivo que está cubierta por células adherentes.

3. Material y reactivos.

• Microscopio invertido.
• Cultivo celular en T-falsk.

4. Procedimiento.

En primer lugar deberemos rociar nuestras manos enguantadas con alcohol antes de ir a coger nuestro cultivo celular de la estufa de incubación. Una vez el alcohol se evapore, abriremos la puerta de la estufa y el espejo de cristal que contiene para acceder a las distintas bandejas.

Localizaremos nuestro cultivo y lo extraeremos de la estufa con cuidado, sin derramar su contenido (recuerda que están ligeramente abiertos) ni golpear accidentalmente los T-flasks del resto de los compañeros para evitar salpicaduras y/o contaminaciones. Cerraremos entonces el espejo de cristal y la puerta de la estufa, -evitando no dejarlas abiertas durante mucho tiempo para que no baje la temperatura del interior de la misma-, y la colocaremos en el microscopio invertido.

LUNES, 26 DE NOVIEMBRE DE 2018 (3 días después a la realización del cultivo)

En primer lugar observamos en 10x y enfocaremos con el tornillo macrométrico (que acerca o aleja la platina) y micrométrico (que enfoca o desenfoca). Jugaremos con ambos tornillos hasta dar con el punto en el que veamos con mayor nitidez. 

En un principio pensamos que lo que vimos eran células; sin embargo, resultaron ser levaduras.

Movimos el T-flask a lo largo de la superficie de la platina y seguimos enfocando y alejando o acercando la platina hasta encontrar algunas células.

Una vez las encontramos, comenzamos a colocar los objetivos del microscopio en valores mayores. Éstas fueron las imágenes:

-Resultados y análisis de resultados: confluencia alrededor del 10%. Las células están enfermas y algunas incluso en proceso de apoptosis. Han proliferado levaduras en nuestro cultivo debido a contaminación, a pesar de realizar correctamente la técnica aséptica.

VIERNES, 30 DE NOVIEMBRE DE 2018 (una semana después a la realización del cultivo y un día después al cambio de medio).

Al 10x, obervamos que las levaduras seguían, ésta vez intercaladas con algunas células:

Seguimos aumentando los objetivos progresivamente. 

En 20x:

 En 40x:

-Resultados y análisis de resultados: la confluencia ha aumentado probablemente debido al cambio del medio, llegando a alrededor de un 15%. La contaminación por levaduras sigue estando presente en el cultivo y la mala salud de las células es constante, pues siguen insanas y algunas están en apoptosis.

5. Consideraciones de seguridad.

 Es indispensable utilizar bata y guantes en el laboratorio.

Al manejar el microscopio y la estufa de incubación, deberemos atender a los riesgos que supone manejar instalaciones eléctricas (que el agua no toque la toma, desenchufar y enchufar con delicadeza, etc...).

Extraeremos el cultivo de la estufa con cuidado para no golpear accidentalmente los T-flasks del resto de los compañeros y evitar salpicaduras y/o contaminaciones (recordemos que algunos T-flask están ligeramente abiertos)

Cerraremos el espejo de cristal y la puerta de la estufa, evitando dejarlas abiertas el mínimo tiempo posible para evitar la bajada de temperatura del interior de la estufa, la entrada de microorganismos exógenos a los cultivos o salida de aerosoles, entre otros.