Práctica 6: Cambio del medio de cultivo.

1. Objetivo.

Renovación del medio de cultivo.

2. Fundamento.

Un medio de cultivo es una sustancia compuesta por compuestos nutritivos que imitan el entorno natural de las células. Contiene fuentes de nitrógeno, carbono y vitaminas, suero descomplementado, indicadores del pH, sales minerales, tampones y antibióticos y/o antifúngicos, entre otros.

Las células de insectos cultivadas requieren una fuente consistente de nutrientes para crecer y dividirse, los cuales se proporcionan en el medio de células de insectos. Con el tiempo, las células agotan los nutrientes y factores de crecimiento del medio, acumulando  productos de desecho tóxicos de las células en el medio de cultivo. Las células dejadas en estas condiciones finalmente morirían, por lo que es importante cambiar regularmente los medios para mantener un cultivo sano. 

3. Material y reactivos.

• Baño termostático.
• Alícuota con penicilina (medio de cultivo).
• Gradilla.
• Pipeta de 2 ml.
• Auxiliar de pipeteo.
• Cultivo celular en T-flask.

4. Procedimiento.

En primer lugar, colocaremos la alícuota con el medio de cultivo (penicilina) contenido en él dentro del baño termostático, el cual programaremos a 37º.

Comenzaremos dejando activado la opción de rayos UV en la cabina de flujo laminar durante 10 minutos debido a su acción germicida, sin todavía colocar en la superficie ningún material; mientras tanto, observaremos la suspensión celular con el microscopio invertido (solo nos dio tiempo a observarlos a 10x y 20x) y prepararemos cerca de la cabina y en un lugar seguro todos los materiales que introduciremos dentro de la misma, además del alcohol en pulverización.

Tras colocarnos todos los EPI correspondientes y haber pasado el tiempo mencionado de aplicación de rayos UV, rociaremos con alcohol nuestras manos enguantadas y posteriormente todos los elementos con los que trabajaremos, con cuidado y uno a uno. Dejaremos para el final, justo cuando la cabina esté terminando su acción germicida, la introducción de la alícuota con penicilina para preservar el máximo tiempo posible su temperatura. Deberemos prestar especial atención a no voltear el T-flask que contiene la suspensión celular, ya que estará un poco abierto y podría salir contenido al exterior. Cuando terminemos, volveremos a rociar nuestras manos.

Antes de empezar con el procedimiento ordenaremos la superficie de trabajo según lo que vayamos a realizar (T-falsk a la izquierda, gradilla en la parte superior, pipeta y su auxiliar a la derecha... etc.). Desenrroscaremos los tapones tanto de la alícuota como del T-flask para que nos sea más fácil abrirlos con una sola mano.

Abriremos  cada cara del plástico que contiene la pipeta de 2 ml. Debe quedar asomada del plástico la punta superior de la pipeta para, con la mano derecha, coger y colocar mediante presión el pipeteador automático en ella.

Para renovar el medio de cultivo será necesario verter 2 ml de penicilina previamente calentados en el baño termostático en el cultivo celular. Para ello, abriremos el tapón de la alícuota y lo dejaremos boca arriba en un lugar en el que no sea posible pasar por encima  nuestras manos (normalmente en la parte superior) y cogeremos la alícuota con la mano izquierda hasta ponerla a la altura de nuestros ojos. Suspendida en el aire la colocaremos en diagonal para introducir la pipeta en vertical y enrasar en 2 ml.

Sacamos la pipeta y ponemos la alícuota en la gradilla, sin olvidarnos después de dejar encima de ella su correspondiente tapón.

Abrimos nuevamente el tapón del T-flask y lo cogeremos con la mano izquierda. Verteremos en él, tal y como se ha descrito anteriormente la posición de los objetos para el pipeteo, los 2 ml contenidos en la pipeta que tendremos en la mano derecha.

Cerraremos el cultivo celular con el tapón, dejándolo un poco abierto, y etiquetaremos la fecha del cambio de cultivo. Una vez así, llevaremos el cultivo al interior de la estufa de incubación.

5. Consideraciones de seguridad.

Debemos prestar especial atención a no utilizar nunca la cabina de flujo laminar con los rayos UV debido al riesgo cancerígeno que supone. Además, es indispensable utilizar bata y guantes en el laboratorio.

Si conectamos o desconectamos la cabina de la toma de contacto, deberemos atender a los riesgos que supone manejar instalaciones eléctricas (que el agua no toque la toma, desenchufar y enchufar con delicadeza, etc...).

Recordamos, además, la importancia de la no contaminación de la penicilina y la suspensión de células así como de los tubos que las contendrán y el volumen que verteremos de ellos. Éstos diversos factores se tratarán de evitar mediante una técnica aséptica óptima. 

Es importante evitar, en medida de lo posible, la realización de la práctica en caso de alergia a la penicilina.

Extraeremos el cultivo de la estufa con cuidado para no golpear accidentalmente los T-flasks del resto de los compañeros y evitar salpicaduras y/o contaminaciones (recordemos que algunos T-flask están ligeramente abiertos)

Cerraremos el espejo de cristal y la puerta de la estufa, evitando dejarlas abiertas el mínimo tiempo posible para evitar la bajada de temperatura del interior de la estufa, la entrada de microorganismos exógenos a los cultivos o salida de aerosoles, entre otros. 

6. Gestión de residuos.

Utilizamos un vaso de precipitado grande etiquetado como residuos para depositar los plásticos y las pipetas en él una vez fueron usados. Colocamos el mismo en la parte superior derecha.