Práctica 10: CARIOTIPO. Siembra de sangre periférica.

1. Objetivo.

Realizar un cultivo celular de sangre periférica para que los linfocitos T proliferen.

2. Fundamento. 

Un cultivo celular es el proceso mediante el que células, ya sean procarios o eucariotas, pueden cultivarse en condiciones controladas. En esta ocasión vamos a cultivar una muestra de sangre humana para que los linfocitos T de la muestra proliferen y podamos realizarle el cariotipo, el cual es el objetivo principal de las prácticas 9, 10...*. Para que las células se 'siembren', es preciso que tengan un medio de cultivo que las nutra: nosotros utilizaremos el medio de cultivo RPMI 1640. Además, también se tendrá que añadir en el cultivo fitohemaglutinina, la cual es una lectina que estimula la proliferación de linfocitos T y desdiferenciación a linfoblastos.

3. Material y reactivos.

• Micropipeta de rango de volúmenes 100 a 1000 microlitros.
• Gradilla.
• Tubo de hematología con heparina (verde).
• Medio de cultivo RPMI 1640.
• Fitohemaglutinina.

4. Procedimiento.

Lo primero que debemos de hacer es atemperar el medio de cultivo RPMI 1640 -que se encontrará congelado- en el baño termostático. Mientras tanto, es preciso obtengamos la muestra de sangre, que será la nuestra propia y nos la extraerá un profesor del centro titulado en enfermería:

La muestra es de 1 ml y el tubo contiene heparina, un glicosaminoglicano muy sulfatado cuyo fin es no permitir la coagulación de la sangre (anticoagulante).

Durante toda la práctica deberemos llevar a cabo la técnica aséptica por lo que comenzaremos dejando activada la opción de rayos UV en la cabina de flujo laminar durante 10 minutos debido a su acción germicida. Mientras tanto, prepararemos todo el material cerca de la cabina (incluido el medio de cultivo atemperado a 37º).

Cuando pasen los 10 minutos, rociaremos nuestras manos enguantadas con alcohol y, seguidamente, todos los materiales que hemos preparado. Conforme vayamos rociándolos con alcohol, iremos introduciendolos dentro y, una vez estén todos en su interior, volveremos a rociar nuestras manos y a colocarlos de la manera que nos sea más cómodo y no de lugar al cruce de manos. Ya no podremos sacar nuestras extremidades de la cabina.

Fijaremos el volumen de 250 microlitros y abriremos los tapones de la fitohemaglutinina y del medio de cultivo, dejándolos lejos del espacio de trabajo (en la periferia) siempre boca arriba. Colocamos una punta de micropipeta en la micropipeta y presionamos hasta el primer émbolo, lo dirigimos hasta el tubo de la fitohemaglutinina e introducimos la punta, donde soltaremos el émbolo.

Seguidamente conducimos la micropipeta hasta la alícuota que contiene el medio de cultivo y presionamos hasta el 2º tope.

Desechamos la punta de la micropipeta y volvemos a renovarla con otra (abriendo y cerrando el envase con la mano que nos quede libre). 

Volveremos a pipetear, siendo esta vez 400 microlitros de sangre completa de la muestra anterior y teniendo en cuenta que previamente deberemos mezclar la sangre presionando y aflojando el émbolo lentamente para que todo contenga la misma cantidad de hematíes, glóbulos blancos, etc... . Los 400 microlitros serán vertidos a la anterior disolución de fitohemaglutinina y medio RPMI 1640.

5. Consideraciones de seguridad.

Debemos prestar especial atención a no utilizar nunca la cabina de flujo laminar con los rayos UV debido al riesgo cancerígeno que supone. Además, es indispensable utilizar bata y guantes en el laboratorio.

Si conectamos o desconectamos la cabina de la toma de contacto, deberemos atender a los riesgos que supone manejar instalaciones eléctricas (que el agua no toque la toma, desenchufar y enchufar con delicadeza, etc...).
Recordamos, además, la importancia de la no contaminación de los reactivos y la muestra de sangre así como de los tubos que las contendrán y el volumen que verteremos de ellos. Éstos diversos factores se tratarán de evitar mediante una técnica aséptica óptima. 

Introduciremos el cultivo de la estufa con cuidado para no golpear accidentalmente los tubos del resto de los compañeros y evitar salpicaduras y/o contaminaciones.

Cerraremos el espejo de cristal y la puerta de la estufa, evitando dejarlas abiertas el mínimo tiempo posible para evitar la bajada de temperatura del interior de la estufa, la entrada de microorganismos exógenos a los cultivos o salida de aerosoles, entre otros. 

6. Gestión de residuos.

Tanto la punta de micropipeta que ha entrado en contacto con la sangre y el tubo que contenía la muestra se desecharán en el contenedor de residuos biológicos. El resto son desechados en un vaso de precipitado etiquetado como 'residuos', que irán a la papelera común.