1. Objetivo.
Obtener portaobjetos con muestras de linfoblastos rotos cuyos cromosomas se encuentren extendidos y en metafase.
2. Fundamento.
El objetivo principal de la Citogenética es el diagnóstico de enfermedades genéticas, por lo que su principal herramienta para llevarlo a cabo es mediante el cariotipo. El cariotipo es el conjunto de los cromosomas de una célula, de un individuo o de una especie, después del proceso en que se unen por pares de cromosomas idénticos y se clasifican según determinados criterios. Se expresa según una fórmula cromosómica determinada; este es el ejemplo de 46, XX (mujer sana).
Nosotros realizaremos un cariotipo de sangre periférica que previamente hemos cultivado en medio RPMI 1640 al que le hemos añadido fitohemaglutinina para desdiferenciar los linfocitos a linfoblastos y proliferarlos. En ésta parte del cariotipo detendremos la mitosis en metafase mediante colchicina, un fármaco antimitótico que detiene o inhibe la división celular al destruir el huso mitótico; 'sacrificaremos' la sangre (centrifugación y eliminación del sobrenadante, en el que se encontrará aquello que no necesitamos: glóbulos rojos, medio de cultivo, fijador de Carnoy sobrante...); fijaremos los linfoblastos con fijador de Carnoy y extenderemos los cromosomas vertiendo gotas de la disolución a una determinada altura.
3. Materiales.
- Estufa de incubación.
- Baño termostático.
- Colchicina.
- Cultivo de sangre con tripsina.
- Micropipeta.
- Puntas de micropipeta.
- Centrífuga.
- Vaso de precipitado.
- KCl.
- Tres pipetas Pasteur estériles: A, B y C.
4. Procedimiento.
Detención de la mitosis en metafase.
Tras la incubación de la sangre a 37º, extraeremos el tubo de la estufa de cultivo para homogeneizar su contenido precipitado por el reposo con 0'25 ml de colchicina con la micropipeta. Abriremos el tapón del tubo, fijaremos el volumen en 250 microlitros y presionaremos hasta el primer émbolo fuera de él hasta llegar al interior del tubo que contenga la colchicina, donde aflojaremos el dedo. Pipetearemos presionando hasta el 2º émbolo el volumen del fármaco en el tubo del cultivo de sangre que previamente habremos abierto su tapón y dejado boca arriba fuera de la zona de trabajo.
Homogeneizaremos la disolución resultante presionando y aflojando el émbolo con suavidad debido a que los glóbulos rojos y los leucocitos se encontrarán formando un coágulo en el fondo del tubo que deberemos de diluir.
Dejaremos que surja el efecto durante 45 minutos en el baño termostático a 37º.
Sacrificio de sangre.
Llevaremos el cultivo anterior a la centrífuga que programaremos a 1.000 rpm durante 5 minutos.
A partir de ahora, vamos a utilizar las tres pipetas estériles que nombraremos según su función:
- Pipeta A - pipeta de trabajo (entrará en contacto con el cultivo)
- Pipeta B - entrará en contacto con el KCl.
- Pipeta C - entrará en contacto con el fijador de Carnoy.
Ésta es la manera en la que se deben abrir los envoltorios de los materiales estériles:
Cuando finalice, eliminaremos el sobrenadante con la pipeta Pasteur A aprentando la punta superior fuera del líquido y soltándola dentro de él. Verteremos el desecho en el vaso de precipitado que utilizamos como bote de residuos. En el tubo quedarán los elementos de la sangre más densos: glóbulos rojos, linfoblastos...
Choque hipotónico.
Añadiremos con la pipeta Pasteur B, en primer lugar, 1 ml de KCl y homogeneizaremos la mezcla con la pipeta Pasteur A. Una vez no se puedan distinguir los componentes a simple vista, volveremos a introducir en el tubo 4 ml de KCl con la pipeta Pasteur B y mezclaremos con la A.
En total habremos introducido 5 ml de KCl con el objetivo de plasmolizar los glóbulos rojos (los leucocitos no, pues son más resistentes) e ir eliminándolos en los futuros lavados.
Repetiremos el proceso de centrifugación durante 5 min a 1.000 rpm y la eliminación del sobrenadante con la pipeta Pasteur A.
Fijación.
Con la pipeta Pasteur C, introduciremos 1 ml de fijador de Carnoy. El fijador de Carnoy es un fijador ácido (3 partes de metanol : 1 parte de ácido acético) especialmente indicado para preservar ácidos nucleicos (núcleos, cromatina, grumos de Nissl...) y glucógeno. Una vez esté introducido, resuspenderemos (homogeneizaremos) con la pipeta Pasteur A muy despacio para que no se rompan las células.
Repetiremos el mismo proceso pero con 4 ml de fijador de Carnoy.
Tal y como se aprecia en las fotos, el contenido del tubo pasa de ser de un rojo brillante a uno cada vez más oscuro, lo cual es consecuencia directa de la metabolización de la hemoglobina.
Lavado.
Centrifugaremos a 1.000 rpm durante 5' y, cuando terminemos, volveremos a repetir el paso de fijación (añadir 1 ml de Carnoy, mezclar, y añadir 4 ml más). Introduciremos el tubo nuevamente en la centrífufa y la accionaremos.
Calcaremos el paso de fijación hasta que el precipitado esté limpio y transparente, tantas veces como haga falta. En nuestro caso hicieron falta 3 centrifugaciones, quedándose finalmente así:
Extensión.
Para que los linfoblastos rompan su membrana y los cromosomas puedan extenderse, echaremos 4-5 gotas sobre cada portaobjetos que hemos colocado en una superficie estable y lisa a 5-10 cm de altura. Los portaobjetos deben estar previamente mojados con agua fría y etiquetados.
5. Consideraciones de seguridad.
Durante todo el proceso es preciso que tratemos la sangre con extremada delicadeza para no producir hemólisis: no formar burbujas, agitar los tubos, extraer e introducir líquido sin mucha fuerza (por las paredes de los tubos)...
Deberemos colocar los tubos de forma equilibrada y simétrica en la centrífuga, así como cerrar su tapa correctamente.
Es conveniente que tengamos cuidado el material de vidrio, así como examinar el estado de las piezas antes de utilizarlas y desechar las que presenten el más mínimo defecto. También se desechará el material que haya sufrido un golpe de cierta consistencia, aunque no se observen grietas o fracturas.
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