Práctica 16: Extracción de ADN leucocitario.

1. Objetivo.

Extraer el ADN de los linfocitos de sangre venosa.

2. Fundamento.

El ADN se encuentra en el interior del núcleo celular, disperso, muy replegado y unido a proteínas formando la cromatina. Para poder extraerlo es necesario romper las células y separar el núcleo del resto de los componentes celulares para después volver a romper su membrana y liberar el ADN. Una vez liberado el ADN es necesario separarlo de las proteínas y provocar la precipitación de éstas, así como finalmente eluír el ADN. Para llevar a cabo dichos procesos deberemos pasar por tres fases: preparación, extracción y purificación. En ésta práctica extraeremos el material genético de los leucocitos, los cuales son células inmunitarias presentes en la sangre, principalmente.

3. Materiales.

4. Procedimiento.

Durante todo el protocolo seguiremos la técnica aséptica, la cual es descrita en la práctica 3 ( https://elenaylosdesoxirribonucleotidos.blogspot.com/2018/11/practica-3-tecnica-aseptica-basica.html )

Sacaremos las dos muestras de sangre venosa anticoagulada de la nevera y atemperaremos con nuestras manos. Además, volveremos a diluirla (ya que sus componentes han sido separados por densidad) revertiendo el tubo una y otra vez con suavidad y lentitud para no romper los hematíes.
Por otro lado, también conectaremos el baño termostático a 65º para que el agua destilada vaya cogiendo la temperatura deseada.

Comenzamos pipeteando 25 microlitros de proteinasa K con una micropipeta (a poder ser fija) a la cual le hemos colocado su correspondiente punta. Éste volumen será llevado a uno de los Eppendorfs, que dejaremos cerrado en la gradilla.

Desechamos la punta utilizada para la proteinasa K y cogemos la otra pipeta -de 300 microlitros-, para pipetear el citado volumen pero de la muestra de sangre venosa. La sangre la llevaremos al anterior eppendorf que contiene la enzima degradadora de proteínas.

Desecharemos nuevamente la punta y le colocaremos una nueva para pipetear 300 microlitros de tampón de lisis/unión. Llevaremos al eppendorf con proteinasa K, sangre y tampón de lisis/unión al vórtex para que todo se diluya correctamente, agitándose alrededor de 10 segundos y, seguidamente, lo introduciremos en el baño termostático a 65º durante 15 minutos.

Después de los 15 minutos, volveremos a introducir el eppendorf en la cabina y le adicionaremos con la micropipeta 300 microlitros de etanol. Diluiremos el etanol con el vórtex, al igual que antes.

Ahora dividiremos la solución en dos mitades: del eppendorf anterior extraemos con la micropipeta 450 microlitros y los vertemos en una spin columna, y los 450 microlitros restantes que quedan en el eppendorf también los llevaremos a la otra spin columna.

En nuestro caso nos equivocamos en éste punto. La primera columna la llenamos correctamente, mientras que la otra fue llenada con 450 microlitros con mayor porcentaje de alcohol debido a que por equivocación repetimos el paso de introducir otros 300 microlitros de alcohol más. Por tanto, le escribiremos una marca a la columna errónea para así diferenciarla durante todo el proceso y observar las diferencias con la correcta.

Llevaremos ambas columnas con su tubo de recogida a la centrífuga que programaremos a 10.000 rpm durante 60 segundos. Desecharemos lo que ha precipitado, el cual se encuentra en el tubo de recogida acoplado al reservorio.

Tal y como hemos dicho antes, una de nuestras soluciones estaba más diluída que la otra; no obstante, es curioso que al ser centrifuugadas, el tubo de recogida del reservorio marcado (más diluído) contenía una disolución más oscura que el anterior porque, al llevar más alcohol, ha lavado más cantidad.

Después de desechar el tubo de recogida, le colocaremos otro e introduciremos en cada spin columna 500 microlitros de tampón de desinhibición. Centrifugaremos las columnas a 12.000 rpm durante 60 segundos y eliminaremos el líquido presente en el tubo de recogida cuando finalice.

Lavaremos dos veces seguidas, repitiendo los mismos pasos anteriores: introducimos esta vez 500 microlitros de tampón de lavado y centrifugamos a 12.000 rpm durante 60 segundos. Cuando termine, eliminamos lo que haya en el tubo de recogida. 

Repetimos el proceso pero ésta vez centrifugaremos a 14.000 rpm durante 60 segundos.

Cuando eliminemos el precipitado, programaremos la centrífuga a la máxima velocidad durante 2 minutos para terminar de lavar con totalidad y eliminar restos de etanol. Desechar el tubo de recogida.

Finalmente tendremos que eluír el ADN, el cual se encuentra en el reservorio. Para llevarlo a cabo, colocaremos los reservorios en otros dos Eppendorfs diferentes a los anteriores y les pipetearemos 50-200 microlitros de tampón de elución, los cuales llevaremos al baño termostático para incubarlos 1 minuto.

Realizaremos una última centrifugación a velocidad máxima durante 60 segundos. Cuando de la señas de finalización, los eppendorfs contendrán ahora el material genético de los leucocitos.

Llevaremos al congelador a -80º para conservarlo.

 5. Consideraciones de seguridad.

Deberemos prestar especial atención a no utilizar nunca la cabina de flujo laminar con los rayos UV debido al riesgo cancerígeno que supone. Además, es indispensable utilizar bata y guantes en el laboratorio, sobre todo en la realización de una correcta y adecuada técnica aséptica.
Si conectamos o desconectamos la cabina, el baño termostático o la centrífuga de la toma de contacto, deberemos atender a los riesgos que supone manejar instalaciones eléctricas (que el agua no toque la toma, desenchufar y enchufar con delicadeza, etc...)
El baño termostático deberá tener un nivel de agua destilada adecuado a su capacidad y evitaremos moverlo para no provocar salpicaduras.
A la hora de centrifugar, verificaremos que los tubos están correctamente tapados y los equilibraremos (misma cantidad de volumen y colocándolos por pares en fundas opuestas). También comprobaremos que el rotor y la tapa de la centrífuga están bien colocados.

6. Gestión de residuos.

Utilizamos un vaso de precipitado grande etiquetado como 'residuos' para depositar los precipitados y las puntas en él. Colocamos el mismo en la parte superior derecha.