Práctica 17: PCR y espectrofotometría.

1. Objetivo.

Introducirnos en los principios y práctica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) mediante el estudio de la determinación del Rh utilizando para ello la técnica de la PCR.

2. Fundamento.

La PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa) es una técnica avanzada que fue inventada por el bioquímico estadounidense Kary Mullis en 1985. Esta técnica permite amplificar pequeñas regios específicas del ADN en laboratorio. Es decir, consigue que un pequeño segmento de ADN que pasaría desapercibido en un análisis cualquiera se multiplique millones de veces y así sea fácil de detectar.

La técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente.

La espectrofotometría es un método científico utilizado para medir cuánta luz absorbe una sustancia química, midiendo la intensidad de la luz cuando un haz luminoso pasa a través de la solución muestra. En el caso de los ácidos nucleicos, esta técnica nos permite confirmar que contamos con cantidad suficiente de ácidos nucleicos de calidad adecuada antes de llevar a cabo ensayos de PCR cuantitativa en tiempo real.

3. Materiales.

• ADN extraído en Eppendorf.
• Mini Eppendorf.
• Mix PCR.
• Micropipetas
• Auxiliar de pipeteo.
• Gradilla.
• Puntas de micropipeta.
• Cubeta de espectofotometría.
• Espectrofotómetro.
• Termociclador.

4. Procedimiento.

ESPECTROFOTOMETRIA

Para calibrar el espectrofotómetro, vertemos agua destilada en una cubeta y accionamos la máquina con las absorbancias que deseemos. Una vez termine, extraemos la cubeta y la desechamos.

Para medir las absorbancias, el restante ADN que ha sobrado lo pipetearemos con una pipeta Pasteur para llevarlo a una cubeta de espectrofotometría. 

La introducimos en el especrofotómetro y seleccionamos las absorbancias a 260 nm, 320 nm y 280 nm. 

Con los datos obtenidos podremos calcular las posibles contaminaciones por proteínas de las muestras. El índice de contaminación por proteínas es (A260/A280) y debe estar entre un 1'7-2 en el caso del ADN.

PCR

Primeramente encendemos la cabina de seguridad biológica y activamos los rayos UV durante 10 mins; mientras tanto, atemperamos con nuestras manos las muestras de ADN extraídas en la práctica 17, así como todos los reactivos necesarios. Cuando alcancen la temperatura ambiente, rociamos con alcohol todo el material y lo vamos introduciendo dentro de la cabina (siempre y cuando ya haya parado su acción bactericida). Por último, volvemos a rociar nuestras manos y comenzamos a trabajar en ella.

Seleccionamos los microlitros que queremos extraer (2.5), abrimos el recipiente de las puntas y presionamos la micropipeta sobre una de ellas. Abrimos el Eppendorf con una mano y extraemos con la otra 2.5 microlitros de la muestra de ADN contenida, los cuales los conduciremos al mini eppendorf y presionaremos el émbolo hasta el final. Cerramos la tapa del mini eppendorf.

Ajustamos el volumen de la otra micropipeta y le colocamos su punta correspondiente. Nuevamente pipeteamos 22.50 microlitros de mix PCR (resuspendiendo previamente) y los llevamos al mini eppendorf con el ADN. Volvemos a resuspender la solución, desechamos la punta y cerramos el mini Eppendorf.

Llevamos el mini Eppendorf al termociclador. Encendemos el mismo y le damos a la opción de 'PCR', que se encuentra en 'programas guardados'.

5. Consideraciones de seguridad.

Deberemos prestar especial atención a no utilizar nunca la cabina de flujo laminar con los rayos UV debido al riesgo cancerígeno que supone. Además, es indispensable utilizar bata y guantes en el laboratorio, sobre todo en la realización de una correcta y adecuada técnica aséptica.

Si conectamos o desconectamos la cabina, el termociclador o el espectrofotómetro de la toma de contacto, deberemos atender a los riesgos que supone manejar instalaciones eléctricas (que el agua no toque la toma, desenchufar y enchufar con delicadeza, etc...).

Con el espectrofotómetro no miraremos directamente a la llama ni a las fuentes de emisión (lámparas).

Mantendremos el orden en el área de trabajo para evitar, entre otros, posibles caídas de reactivos y material de vidrio. Además, deberemos examinar el estado de las piezas antes de utilizarlas y desechar las que presenten el más mínimo defecto, así como desechar el material que haya sufrido un golpe de cierta consistencia,

aunque no se observen grietas o fracturas.

6. Gestión de residuos.

Utilizamos un vaso de precipitado grande etiquetado como 'residuos' para depositar los las puntas en él. Colocamos el mismo en la parte superior derecha.