Práctica 18: Electroforesis.

1. Introducción.

Las electroforesis son técnicas de separación de mezclas para su caracterización que se basan en la diferencia de movilidad en un campo eléctrico de las moléculas que las forman. El equipo está formado por una fuente de alimentación eléctrica, una cubeta con dos recipientes y un puente, y un soporte. Una de los tipos de ellas es la electroforesis en gel de agarosa, el cual es el soporte que utilizamos.

2. Objetivo.

Realizar una electroforesis con muestras de gen Rh amplificado.

3. Materiales.

• Equipo de electroforesis.
• Matraz aforado de 100ml.
• Embudo.
• Agarosa.
• Vaso de precipitado.
• Agua destilada en vaso de precipitado.
• GELSAFE.
• Varilla.
• Espátula.
• Balanza.
• Frasco.
• Probeta.
• Pipeta Pasteur.
• Tampón TAE.
• Pipeta.
• Auxiliar de pipeteo.
• Micropipetas
• Puntas de micropipeta.
• Gradillas con ADN amplificado.
  
  

  4. Procedimiento.

  Preparación del gel de agarosa.
  El gel de agarosa que necesitamos tiene una concentración de 0’9 g en 100 ml. Por tanto, primeramente pasaremos el soluto (la agarosa) sobre un vaso de precipitado previamente tarado y con ayuda de la espátula; una vez lleguemos a 0’8, sustraemos el vaso de la balanza y le vertemos una cantidad indeterminada de agua destilada. Removemos con la varilla hasta diluirlo y, una vez homogeneizado, lo hacemos pasar por un embudo colocado sobre el cuello del matraz de 100 ml.
  Enrasamos en 100 ml con agua destilada hasta el aforo del matraz y movemos el matraz delicadamente en movimientos circulares.
  Una vez así, vertemos la disolución del matraz a un frasco (si es necesario, utilizamos el embudo). El frasco lo llevaremos al microondas, que programaremos para llevarlo a ebullición (es decir, cuando empieza a burbujear, pararlo).
  
  
  
  Por último, le añadiremos 4’5 microlitros de GELSAFE con una micropipeta adecuada y su correspondiente punta (para poder visualizar luego las bandas con la luz ultravioleta). Homogeneizamos agitándolo circularmente y con cuidado.
  
  
  
  Dejamos enfriar la solución hasta 55º aproximadamente y, cuando pase el tiempo suficiente, la vertemos en un molde y, finalmente, le colocamos el peine encima para elaborar los pocillos de siembra. A medida que se enfríe irá gelificando, por lo que lo dejaremos reposar así 20 minutos.
  
  
  
  Preparación del tampón TAE.
  Mientras realizamos el gel de agarosa, otro grupo tendrá que preparar 160 ml de disolución de tampón TAE 10x (debido a que necesitamos 300 ml y en el laboratorio solo tenemos 149); en consecuencia, lo conseguiremos con 16 ml de tampón TAE y el resto, de agua destilada.
  Pipeteamos 16 ml con una pipeta que abarque dicho volumen y su correspondiente auxiliar. Llevamos dicho volumen a una probeta de 250 ml y soltamos el émbolo. Enrasamos hasta 160 ml con agua destilada y, finalmente, lo vertemos a través del embudo en el frasco con la disolución de tampón TAE (149 ml) que había en el laboratorio previamente.
  
  
  
  Electroforesis.
  Quitamos el peine y sacamos con delicadeza el gel de agarosa solidificado del molde y lo colocamos en la cubeta.
  
  
  Vertemos en la misma cubeta la disolución de tampón TAE hasta sumergir totalmente el gel de agarosa en el.
  
  
  
  Antes de llenar los pocillos con las muestras de ADN, pipeteamos 7 microlitros de control positivo en el primero y en el segundo, otros 7 microlitros de control negativo. Una vez así, rellenamos el resto con la misma micropipeta y el mismo volumen: abrimos el minieppendorf, presionamos el émbolo de la micropipeta, introducimos la punta, soltamos el émbolo, cerramos el minieppendorf y lo colocamos en la gradilla, y volvemos a presionar el émbolo pero en el siguiente pocillo al control negativo.
  
  
  Seguimos pipeteando todas las muestras en cada pocillo hasta que queden dos: el primero pipetearemos el control negativo, y el segundo el positivo.
  
  
  Cuando todos estén llenos, tapamos y conectamos los electrodos a la fuente de alimentación y a su correspondiente recipiente.
  
  
  Ajustamos a 75V durante 25 minutos y esperaremos. La electroforesis finalizará cuando se produzca la máxima separación de los componentes de la muestra, pero sin sobrepasar los límites del soporte.

  
  Visualización en el transiluminador.
  

  Apagamos la fuente y desenchufamos los electrodos. Cogemos con cuidado el soporte de gel de agarosa, abrimos la tapa y lo colocamos en la pantalla negra que se encuentra en la superficie.

  Cerramos la tapa, enchufamos a la red eléctrica y encendemos el transiluminador.
  

  

  
  

5. Consideraciones de seguridad.

Si conectamos o desconectamos el equipo de electroforesis o el transiluminador de la toma de contacto, deberemos atender a los riesgos que supone manejar instalaciones eléctricas (que el agua no toque la toma, desenchufar y enchufar con delicadeza, etc...).

Los voltajes utilizados en electroforesis pueden proporcionar descargas eléctricas letales. El peligro se incrementa por el uso de soluciones acuosas reguladoras y la posibilidad de trabajar en ambientes húmedos; por tanto, el equipo debe estar dentro de una caja metálica o en una caja de material aislante y los cables deben estar totalmente aislados.
Tendremos especial cuidado al manipular el frasco con agua tras ser llevado a ebullición para evitar quemaduras; además, se deberá controlar la temperatura para no provocar salpicaduras por burbujas. 

Mantendremos el orden en el área de trabajo para evitar, entre otros, posibles caídas de reactivos y material de vidrio. Además, deberemos examinar el estado de las piezas antes de utilizarlas y desechar las que presenten el más mínimo defecto, así como desechar el material que haya sufrido un golpe de cierta consistencia,

aunque no se observen grietas o fracturas.

6. Gestión de residuos.

Utilizamos un vaso de precipitado grande etiquetado como 'residuos'